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ELISA实验标本的采集、处理和保存

发布时间:2019/3/21 8:26:57      阅读次数:348

 ELISA实验标本的采集、处理和保存

ELISA实验标本的采集、处理和保存

 

能够应用ELISA 实验的样本种类很多,有血清,血浆,细胞上清,细胞裂解液,尿液,关节滑液,脑脊液,肺泡灌洗液,各种组织的组织匀浆;采集和处理的方式都不相同。下面就列出了biotnt 收集的给类样本的采集、处理和保存方式。方法大多出自文献和试剂盒说明书,部分方法经Biotnt 验证过,但有的方法并没有实际操作过,所以,以下方法仅供参考。

 

 

一、ELISA实验中血清的采集、处理和保存;

1、 真空采血针采集2ml新鲜血液,加入无菌试管中;

2、 采血后室温静置1小时;

3、 将采集血液用离心机4℃,2500rpm离心10min,,将离心好的匀浆留上清,弃下面沉淀。

4、 取上清。 分装冻存备用,

2-8℃下,可放置保存24-48小时;

-20℃下,可放置保存1个月;

-70℃下,可放置保存6个月;

5、 根据你的实验需要,取适量上清夜进行各种ELISA测定。 

大部分ELISA检测均以血清为标本。血清标本可按常规方法采集,应注意避免溶血,红细胞溶解时会释放出具有过氧化物酶活性的物质,以HRP为标记的 ELISA测定中,溶血标本可能会增加非特异性显色。此外还应避免细菌污染,因为菌体中可能含有含有内源性HRP,也会产生假阳性反应。血清标本宜在新鲜 时检测。如在冰箱中保存过久,其中的可发生聚合,在间接法ELISA中可使本底加深。

 

二、ELISA实验中血浆的采集、处理和保存;

1、 真空采血针采集2ml新鲜血液,加入无菌试管中;

2、 1:9加入抗凝剂(EDTA、草酸钠、肝素、枸橼酸钠),30分钟内于冰上分离血浆以减少血小板的污染;(也可以直接用抗凝管采集);

3、 将采集血液用离心机4℃,2500rpm离心5min,,将离心好的匀浆留上清,弃下面沉淀。

4、 取上清。 分装冻存备用,

2-8℃下,可放置保存24-48小时;

-20℃下,可放置保存1个月;

-70℃下,可放置保存6个月;

5、 根据你的实验需要,取适量上清夜进行各种ELISA测定。 请注意指标说明书上对于抗凝血剂是否有特殊要求,建议使用EDTA。血浆中除尚含有纤维蛋白原和抗凝剂外,其他成份均同等于血清。

注意事项:制备血浆标本需借助于抗凝剂EDTA,抗凝不完全的标本因纤维蛋白原干扰而造成假阳性。

 

三、ELISA 实验中尿液的采集、处理和保存;

1、 采集尿液样本500ul,加入无菌试管中;

2、 将采集血液用离心机4℃,2500rpm离心10min,,将离心好的样本留上清,弃下面沉淀。

3、 取上清。 分装冻存备用,

2-8℃下,可放置保存24-48小时;

-20℃下,可放置保存1个月;

-70℃下,可放置保存6个月;

4、 根据你的实验需要,取适量上清夜进行各种ELISA测定。

 

四、ELISA 实验中脑脊液的采集、处理和保存;

1、采集脑脊液样本,加入无菌试管中;

2、将采集血液用离心机4℃,2500rpm离心10min,,将离心好的样本留上清,弃下面沉淀。

3、取上清。 分装冻存备用,

2-8℃下,可放置保存24-48小时;

-20℃下,可放置保存1个月;

-70℃下,可放置保存6个月;

4、根据你的实验需要,取适量上清夜进行各种ELISA测定。

 

五、ELISA 实验中细胞上清液的采集、处理和保存;

1、采集细胞培养上清液500ul,加入无菌试管中;

2、将采集血液用离心机4℃,2500rpm离心10min,,将离心好的匀浆留上清,弃下面沉淀。

3、取上清。 分装冻存备用,

2-8℃下,可放置保存24-48小时;

-20℃下,可放置保存1个月;

-70℃下,可放置保存6个月;

4、根据你的实验需要,取适量上清夜进行各种ELISA测定。

 

六、ELISA 实验中细胞裂解液的采集、处理和保存;(需要测蛋白浓度)

1、 取细胞培养板或细胞悬液,PBS(PH7.2-7.4)洗涤细胞培养板1-2次。

2、 通过反复冻融或加入组织蛋白萃取试剂(裂解液),使细胞破坏并放出细胞内成份。

3、 将采集血液用离心机4℃,2500rpm离心20min,,将离心好的匀浆留上清,弃下面沉淀。

4、 取上清。 分装冻存备用,

2-8℃下,可放置保存24-48小时;

-20℃下,可放置保存1个月;

-70℃下,可放置保存6个月;

5、 根据你的实验需要,取适量上清夜进行各种ELISA测定。

 

七、ELISA 实验中肺泡灌洗液的采集、处理和保存;

1、 10%水合氯醛溶液,腹腔麻醉。

2、 打开腹腔,另取10ml注射器行下腔静脉采血,尽可能将血放尽。

3、 在冰面上对左肺进行肺灌洗。取37℃生理盐水5ml,分三次灌洗:2ml1.5ml1.5ml灌洗。回收率在70%以上。

4、 肺泡灌洗液用离心机4℃,1500rpm离心10min。

5、 取上清。 分装冻存备用,

2-8℃下,可放置保存24-48小时;

-20℃下,可放置保存1个月;

-70℃下,可放置保存6个月;

6、 根据你的实验需要,取适量上清夜进行各种ELISA测定。

 

八、ELISA 实验中关节滑液的采集、处理和保存;

1、 口腔关节:患者取坐位,常规消毒后,作皮下及关节后区局部浸润麻醉。然后嘱患者大张口,采用装有2ml生理盐水的注射器(5号针头)作关节上腔 穿刺,髁后进针,针尖方向斜向前、内、上,抵达关节结节后斜面后稍后退,回抽如发现有淡黄色液体,即表明已进入关节上腔,注入2ml生理盐水,反复注入、 回抽五次。

   膝骨关节滑液:无菌穿刺取得关节液。

2、 关节液用离心机4℃,1500rpm离心15min,将离心好的匀浆留上清,弃下面沉淀。

3、 取上清。 分装冻存备用,

2-8℃下,可放置保存24-48小时;

-20℃下,可放置保存1个月;

-70℃下,可放置保存6个月;

4、 根据你的实验需要,取适量上清夜进行各种ELISA测定。

 

九、 ELISA实验中各类组织匀浆(容易匀浆的组织)的采集、处理和保存;(需要测蛋白浓度)

1、 采集组织,在冰冷的生理盐水中漂洗,除去血液,滤纸拭干,称重,剔除附属的结缔组织,称取组织块。

2、 用移液管量取0。1M PBS或者用0.86%冷生理盐水,匀浆介质或生理盐水的体积总量应该是组织块重量的9倍,用眼科小剪尽快剪碎组织块(天然时操作要在冰水浴中进行,将盛有组织 的小烧杯放入冰水中)。

3、 匀浆的方式有多种: 

a) 手工匀浆:将剪碎的组织倒入玻璃匀浆管中,再将剩余的1/3匀浆介质或生理盐水冲洗残留在烧杯中的碎组织块,一起倒入匀浆管中进行匀浆,左手持匀浆管将下 端插入盛有冰水混合物的器皿中,右手将捣杆垂直插入套管中,上下转动研磨数十次(68分钟),充分研碎,使组织匀浆化。

b) 机器匀浆:用组织捣碎机1000015000r/min上下研磨制成10%组织匀浆,也可用内切式组织匀浆机制备(匀浆时间10/次,间隙30秒,连续35次,在冰水中进行),皮肤、肌肉组织等可延长匀浆时间。

4、 将制备好的10%匀浆用离心机4℃,3000rpm离心15min,将离心好的匀浆留上清,弃下面沉淀。

5、 取上清。 分装冻存备用,

2-8℃下,可放置保存24-48小时;

-20℃下,可放置保存1个月;

-70℃下,可放置保存6个月;

6、 根据你的实验需要,取适量上清夜进行各种ELISA测定。

 

十、ELISA实验中各类组织匀浆(不易匀浆的组织)的采集、处理和保存;(需要测蛋白浓度)

7、 采集组织在冰冷的生理盐水中漂洗,除去血液,滤纸拭干,称重,剔除附属的结缔组织,称取组织块。

8、 用移液管量取0.1M PBS或者用0.86%冷生理盐水,匀浆介质或生理盐水的体积总量应该是组织块重量的9倍,用眼科小剪尽快剪碎组织块(天然时操作要在冰水浴中进行,将盛有组织 的小烧杯放入冰水中)。

9、 匀浆的方式有多种: 

a) 手工匀浆:将剪碎的组织倒入玻璃匀浆管中,再将剩余的1/3匀浆介质或生理盐水冲洗残留在烧杯中的碎组织块,一起倒入匀浆管中进行匀浆,左手持匀浆管将下 端插入盛有冰水混合物的器皿中,右手将捣杆垂直插入套管中,上下转动研磨数十次(68分钟),充分研碎,使组织匀浆化。

b) 机器匀浆:用组织捣碎机1000015000r/min上下研磨制成10%组织匀浆,也可用内切式组织匀浆机制备(匀浆时间10/次,间隙30秒,连续35次,在冰水中进行),皮肤、肌肉组织等可延长匀浆时间。

c) 超声粉碎:用超声粉碎机进行粉碎,可用Soniprep150型超声波发生器以振幅14微米超声处理30秒使细胞破碎,也可用国产超声波发生仪,用40安培,5/次,间隙10秒反复35次。

10、 将制备好的10%匀浆用离心机4℃,3000rpm离心15min,将离心好的匀浆留上清弃下面沉淀。

11、 取上清。 分装冻存备用,

2-8℃下,可放置保存24-48小时;

-20℃下,可放置保存1个月;

-70℃下,可放置保存6个月;

12、 根据你的实验需要,取适量上清夜进行各种ELISA测定。

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